Кислые гликозаминогликаны

Кусочек ткани для световой микроскопии фиксировался в течение 12-24 ч, обезвоживался и заливался в парафин. Кусочки для заливки в эпоксидные смолы после фиксации в 4%-ном растворе параформальдегида промывались в трех порциях фосфатного буфера Миллонига (рН 7,2-7,4) в течение 30 мин. Далее следовала фиксация в 1%-ном растворе четырехокиси осмия в течение 1,5-2 ч. После фиксации кусочки быстро промывали в двух сменах буферного раствора, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, проводили через эфир (или пропиленоксид) и заливали в эпоксидные смолы. Мы пользовались смесью эпона. Если возникала необходимостьотложитьпроводку биоптатов, мы хранили материал в 4%-ном растворе параформальдегида при температуре 4°С, контролируя величину рН. С парафиновых блоков готовились срезы толщиной 3-5 мкм. С каждого блока, залитого в эпоксидные смолы, вначале готовились полутонкие срезы (1 мкм), а затем ультратонкие. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим или азуром-2. Применялись 1%-ные растворы красителей, приготовленные на 1%-ном водном растворе буры, которая повышает рН до 9. Раствор красителя перед окраской подогревался до 60-70°С на водяной бане. Окрашивали капельно в течение 10 мин, споласкивали в двух порциях дистиллированной воды, после чего срезы высушивались в течение суток при комнатной температуре, затем около 4-5 мин просветлялись в ксилоле и заключались в полистерол. Для ультратонких срезов использовался классический метод двойного окрашивания цитратом свинда и урапилацетатом. При необходимости проводили реакцию с рутениевым красным для выявления внеклеточных кислых мукоидов (гликокаликса). Использовали метод Люфта но прописи Гайера (1974). В этих случаях часть биоптата фиксировали 1 ч при 4°С в 3,6%-ном растворе глютаральдегида (0,5 мл), 0,3%-ном водном растворе рутениевого красного (0,5 мл) и 0,5 М какодилатном буфере с рН 7,3 (0,5 мл).

Автор: admin2